在生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室中，HEK293 細(xì)胞培養(yǎng) 是一項(xiàng)基礎(chǔ)且至關(guān)重要的技能。作為一種易于轉(zhuǎn)染且蛋白表達(dá)能力強(qiáng)的人胚腎上皮細(xì)胞系，HEK293 細(xì)胞被廣泛應(yīng)用于病毒包裝、重組蛋白生產(chǎn)以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究。然而，要獲得高活力、狀態(tài)穩(wěn)定的細(xì)胞，必須嚴(yán)格遵守標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）。本文將詳細(xì)介紹 HEK293 細(xì)胞培養(yǎng) 的全流程，包括培養(yǎng)基配置、細(xì)胞復(fù)蘇、傳代、凍存及常見問(wèn)題排查，助力科研人員建立穩(wěn)健的細(xì)胞培養(yǎng)體系。
一、 培養(yǎng)基與試劑的準(zhǔn)備
成功的 HEK293 細(xì)胞培養(yǎng) 始于優(yōu)質(zhì)的試劑準(zhǔn)備。HEK293 細(xì)胞通常采用貼壁生長(zhǎng)方式，對(duì)營(yíng)養(yǎng)需求較高。
基礎(chǔ)培養(yǎng)基： 推薦使用高糖型 DMEM 培養(yǎng)基。高糖環(huán)境能夠滿足 HEK293 細(xì)胞快速增殖的能量需求。
血清補(bǔ)充： 需添加胎牛血清（FBS），濃度通常為 10%。優(yōu)質(zhì)的胎牛血清能提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的生長(zhǎng)因子、激素和貼壁因子。建議選擇經(jīng)過(guò)嚴(yán)格質(zhì)檢、內(nèi)毒素低的熱滅活或非熱滅活血清（視實(shí)驗(yàn)具體需求而定）。
雙抗添加： 為預(yù)防細(xì)菌污染，通常在培養(yǎng)基中添加 1% 的青霉素 - 鏈霉素溶液（Penicillin-Streptomycin）。
消化液： 常用的為 0.25% 胰蛋白酶 - EDTA 消化液。由于 HEK293 細(xì)胞對(duì)胰酶較為敏感，消化時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。
二、 細(xì)胞復(fù)蘇
復(fù)蘇是 HEK293 細(xì)胞培養(yǎng) 的第一步，目標(biāo)是最da程度減少冰晶對(duì)細(xì)胞造成的損傷。
快速解凍： 從液氮罐中取出凍存管后，應(yīng)迅速投入 37℃ 水浴中。輕輕晃動(dòng)凍存管，確保在 1-2 分鐘內(nèi)wan全解凍（注意：不要將凍存管口浸入水中，以防污染）。
離心洗滌： 將解凍后的細(xì)胞懸液吸入含有 5ml wan全培養(yǎng)基的離心管中，在 1000 rpm 轉(zhuǎn)速下離心 5 分鐘，目的是去除凍存液中的 DMSO（二甲基亞砜），因?yàn)?DMSO 在常溫下對(duì)細(xì)胞有毒性。
重懸接種： 棄去上清液，加入新鮮wan全培養(yǎng)基重沉細(xì)胞沉淀。將細(xì)胞懸液接種至培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，置于 37℃、5% CO2 的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。
觀察換液： 次日顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁情況，若細(xì)胞密度較高且死細(xì)胞較少，可更換新鮮培養(yǎng)基以去除殘留的死細(xì)胞。
三、 細(xì)胞傳代
當(dāng) HEK293 細(xì)胞匯合度達(dá)到 80%-90% 時(shí)，必須進(jìn)行傳代，以防止細(xì)胞因接觸抑制而發(fā)生老化或自分化。
棄去舊液： 吸除舊的培養(yǎng)基，用 PBS 緩沖液輕輕清洗細(xì)胞表面一次，以去除殘留的血清（血清會(huì)抑制胰酶活性）。
胰酶消化： 加入適量 0.25% 胰酶（覆蓋瓶底即可），置于 37℃ 培養(yǎng)箱中消化 1-2 分鐘，或在顯微鏡下觀察細(xì)胞回縮變圓。
終止消化： 加入含血清的wan全培養(yǎng)基，胰酶與血清接觸后立即失去活性。輕輕吹打瓶壁，使細(xì)胞wan全脫落并分散成單細(xì)胞懸液。
分裝培養(yǎng)： 按照 1:3 至 1:6 的比例將細(xì)胞懸液分裝至新的培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)足培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)。
四、 細(xì)胞凍存
為了防止細(xì)胞長(zhǎng)期傳代導(dǎo)致變異或污染，定期對(duì)
HEK293 細(xì)胞培養(yǎng) 物進(jìn)行凍存?zhèn)浞菔潜匾摹?/div>
收集細(xì)胞： 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按照上述傳代步驟消化并離心收集。
配制凍存液： 推薦使用 90% wan全培養(yǎng)基 + 10% DMSO，或者使用專用的細(xì)胞凍存液。
重懸分裝： 用凍存液重懸細(xì)胞，調(diào)整密度至 1×10^6 cells/ml 左右。將細(xì)胞懸液分裝入凍存管。
梯度降溫： 使用程序降溫盒（如 Mr. Frosty）置于 -80℃ 冰箱過(guò)夜，使細(xì)胞以 -1℃/ 分鐘的速度緩慢降溫，次日將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮罐中長(zhǎng)期保存。
五、 常見問(wèn)題與注意事項(xiàng)
在進(jìn)行 HEK293 細(xì)胞培養(yǎng) 時(shí)，可能會(huì)遇到以下挑戰(zhàn)：
生長(zhǎng)緩慢： 可能是血清質(zhì)量下降、培養(yǎng)基 pH 值不適宜或細(xì)胞代數(shù)過(guò)高。建議更換優(yōu)質(zhì)血清或復(fù)蘇低代數(shù)細(xì)胞種。
狀態(tài)不佳（發(fā)亮、漂浮）： 可能是消化過(guò)度或培養(yǎng)箱 CO2 濃度波動(dòng)。應(yīng)嚴(yán)格控制消化時(shí)間，并定期校準(zhǔn)培養(yǎng)箱環(huán)境。
污染： 無(wú)菌操作是 HEK293 細(xì)胞培養(yǎng) 的生命線。所有操作應(yīng)在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行，定期檢查支原體污染。
掌握規(guī)范的 HEK293 細(xì)胞培養(yǎng) 技術(shù)，是開展后續(xù)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)和功能研究的基礎(chǔ)。通過(guò)精細(xì)化的培養(yǎng)基配置、嚴(yán)格的復(fù)蘇傳代操作以及科學(xué)的凍存策略，可以確保 HEK293 細(xì)胞始終保持高活性和良好的實(shí)驗(yàn)重復(fù)性。
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更新時(shí)間：2026-07-01
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