明明凍存的時(shí)候細(xì)胞長得好好的，怎么一復(fù)蘇就完啦？

不知道大家是否會(huì)遇到細(xì)胞凍存的時(shí)候狀態(tài)非常不錯(cuò)，結(jié)果等到需要用到該細(xì)胞的時(shí)候怎么也復(fù)蘇不起來的情況??？或許可能是凍存細(xì)胞的時(shí)候出現(xiàn)了什么差錯(cuò)？

一.細(xì)胞凍存的原則：慢凍，細(xì)胞在冷凍過程中，如果降溫過快，會(huì)形成大的冰晶，這些冰晶會(huì)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

詳細(xì)版本見《細(xì)胞凍存的原理是什么？》

二.凍存液的配置：

常用配置比例：培養(yǎng)基:血清:DMSO=7:2:1

適用于大多數(shù)細(xì)胞系，能夠保證細(xì)胞在凍存過程中有較高的存活率。

血清:DMSO=9:1

適用范圍：適用于需要長時(shí)間保存或者具有特別珍貴性的細(xì)胞系。血清含量高，可以更好地保護(hù)細(xì)胞，并確保其在凍存后依然保持較好的生物學(xué)特性。

無血清凍存液：適用于某些對血清敏感或需要避免血清成分的細(xì)胞系。配置比例：如10% DMSO+90%專用無血清培養(yǎng)基，或其他適合細(xì)胞生長的無血清替代品。

1.不要將DMSO直接加入含有細(xì)胞的培養(yǎng)基中，因?yàn)镈MSO溶于培養(yǎng)基時(shí)會(huì)釋放大量熱量，可能燙傷細(xì)胞。在加入細(xì)胞前，可以將配置好的凍存液放于4℃進(jìn)行預(yù)冷（預(yù)冷步驟并非必需)。DMSO在4°C時(shí)毒性會(huì)大大減弱，且滲透速度加快，有助于保護(hù)細(xì)胞。

2.若使用凍存盒進(jìn)行凍存，必須將凍存盒解凍至室溫（避免溫度驟變對細(xì)胞的損傷：如果直接將冷凍的凍存盒從低溫環(huán)境取出，并立即打開或處理，細(xì)胞會(huì)受到溫度驟變的影響。

溫度的急劇上升可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成或擴(kuò)大，對細(xì)胞膜和細(xì)胞器造成機(jī)械性損傷，進(jìn)而影響細(xì)胞的存活率。)

3.把握細(xì)胞凍存的密度：應(yīng)確保細(xì)胞處于對數(shù)生長期，形態(tài)正常，無污染，且細(xì)胞密度足夠大，因?yàn)閮龃婧蛷?fù)蘇的過程中不可避免會(huì)導(dǎo)致部分細(xì)胞死亡。

1.配置好細(xì)胞凍存液，置于4℃預(yù)冷備用

2.將待凍存的細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出，棄去舊的培養(yǎng)基，PBS洗滌，對于貼壁細(xì)胞，加入適量胰酶消化液，將培養(yǎng)皿放入37℃培養(yǎng)箱中消化數(shù)分鐘（消化時(shí)間根據(jù)細(xì)胞類型而定）當(dāng)觀察到細(xì)胞大塊大塊地從皿底脫落時(shí)，加入等體積的wan全培養(yǎng)基終止消化。離心收集細(xì)胞；對于懸浮細(xì)胞直接離心收集

3.向離心管中加入適量的凍存液，用移液器輕輕吹打細(xì)胞沉淀，使細(xì)胞均勻懸浮于凍存液中。

4.將重懸后的細(xì)胞懸液分裝至無菌凍存管中，凍存管放入-80過夜，次日轉(zhuǎn)移置液氮保存。