qpcr結(jié)果和wb結(jié)果不一致？為什么呢

qpcr結(jié)果和wb結(jié)果不一致？是什么原因呢？今天讓我們來(lái)探討一下~

一、實(shí)驗(yàn)技術(shù)層面的原因

(1) 樣品制備與處理

在qPCR中，如果總RNA樣品提取環(huán)節(jié)出現(xiàn)失誤，如取材到液氮速凍耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致RNA降解，或在制樣時(shí)沒(méi)有保持低溫環(huán)境、沒(méi)有有效防范外源性RNA酶的污染，都可能影響RNA的質(zhì)量和qPCR結(jié)果的準(zhǔn)確性。

在WB實(shí)驗(yàn)中，蛋白樣品制備環(huán)節(jié)同樣至關(guān)重要。如果取材到液氮速凍耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)或制樣時(shí)沒(méi)有保持低溫環(huán)境，可能導(dǎo)致蛋白降解。此外，如果沒(méi)有加蛋白酶抑制劑，也可能導(dǎo)致蛋白降解。另外，如果蛋白發(fā)生可逆性沉淀，如低溫保存時(shí)蛋白濃度高導(dǎo)致沉淀，或pH值過(guò)低導(dǎo)致蛋白沉淀，也會(huì)影響WB結(jié)果的準(zhǔn)確性。

(2) 實(shí)驗(yàn)操作的精確性

在進(jìn)行qPCR時(shí)，如果引物設(shè)計(jì)策略有誤、引物形成二聚體、熔合曲線呈現(xiàn)雙峰，或引物實(shí)際擴(kuò)增效率未檢測(cè)而默認(rèn)為100%計(jì)算，都可能導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。

在WB實(shí)驗(yàn)中，如果電泳、轉(zhuǎn)膜、抗體孵育、發(fā)光成像等環(huán)節(jié)出現(xiàn)失誤，如電泳電壓不穩(wěn)定、轉(zhuǎn)膜不wanquan、抗體濃度不合適、曝光時(shí)間不當(dāng)?shù)龋矔?huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。

二、生物學(xué)層面的原因

(1) 翻譯后調(diào)控或修飾

有時(shí)蛋白的mRNA水平可能保持不變，但經(jīng)過(guò)翻譯過(guò)程后蛋白的產(chǎn)量顯著增加。因此，即使mRNA水平?jīng)]有變化，也可能出現(xiàn)蛋白水平升高的情況。相反，如果存在一些影響翻譯過(guò)程的因素，也可能導(dǎo)致mRNA水平高而蛋白水平低的情況。

同時(shí)，蛋白質(zhì)在合成后可能會(huì)經(jīng)歷各種翻譯后調(diào)控或修飾過(guò)程，如磷酸化、糖基化、泛素化等。這些修飾過(guò)程可能影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、活性或定位，從而導(dǎo)致WB結(jié)果與qPCR結(jié)果不一致。

(2) 延遲效應(yīng)

蛋白質(zhì)合成需要耗費(fèi)時(shí)間，而mRNA表達(dá)則能迅速響應(yīng)外界刺激。因此，在某些情況下，mRNA的變動(dòng)可能比蛋白質(zhì)水平的變化來(lái)得早或晚，導(dǎo)致兩者之間的結(jié)果不一致的情況。

(3) mRNA剪接多變數(shù)

轉(zhuǎn)錄后的mRNA可能產(chǎn)生多種剪接體。而qPCR往往只針對(duì)其中一段進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)。因此，即使檢測(cè)到的mRNA水平下降了，其他剪接體可能正在增加，導(dǎo)致蛋白質(zhì)水平反而上升，這種現(xiàn)象需要我們特別留意。

(4) 蛋白翻譯后的穩(wěn)定性

蛋白在翻譯后可能會(huì)經(jīng)歷各種修飾，這些修飾可能會(huì)影響蛋白的穩(wěn)定性。舉例來(lái)說(shuō)，增加泛素化修飾可能會(huì)促進(jìn)蛋白通過(guò)蛋白酶體途徑進(jìn)行降解，從而導(dǎo)致蛋白水平下降。

(5) 負(fù)反饋機(jī)制調(diào)節(jié)

細(xì)胞內(nèi)存在負(fù)反饋機(jī)制來(lái)調(diào)節(jié)mRNA和蛋白質(zhì)的水平。有時(shí)蛋白的mRNA水平可能保持不變，但經(jīng)過(guò)翻譯過(guò)程后蛋白的產(chǎn)量顯著增加。因此，即使mRNA水平?jīng)]有變化，也可能出現(xiàn)蛋白水平升高的情況。相反，如果存在一些影響翻譯過(guò)程的因素，也可能導(dǎo)致mRNA水平高而蛋白水平低的情況。這種動(dòng)態(tài)平衡機(jī)制可能導(dǎo)致mRNA和蛋白質(zhì)水平在不同時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)不一致。

三、數(shù)據(jù)處理與分析層面的原因

(1) 定量方法的差異

qPCR和WB分別采用不同的定量方法。qPCR通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的變化來(lái)實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化；而WB則通過(guò)抗體與蛋白質(zhì)的結(jié)合來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。這兩種方法可能在定量范圍和靈敏度上存在差異，導(dǎo)致結(jié)果不一致。

(2) 結(jié)果解讀的主觀性

在進(jìn)行WB結(jié)果分析時(shí)，通常需要根據(jù)蛋白質(zhì)條帶的顏色和深淺來(lái)判斷蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。這種判斷過(guò)程存在一定的主觀-性，可能導(dǎo)致不同研究者對(duì)同一結(jié)果產(chǎn)生不同的解讀。

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