WB實(shí)驗(yàn)之內(nèi)參蛋白的選擇

在進(jìn)行WB（Western Blot）實(shí)驗(yàn)時(shí)，選擇合適的內(nèi)參確實(shí)至關(guān)重要。內(nèi)參的主要作用是像一把“尺子"，用來(lái)衡量和校正每個(gè)樣本的上樣量，以及在上樣過(guò)程中可能產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)誤差。這樣，我們就可以更加確信實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，因?yàn)樗鼈円呀?jīng)經(jīng)過(guò)了內(nèi)參的校正。

一、選擇內(nèi)參需要遵循的原則？

1. 樣本種屬來(lái)源

匹配性原則：內(nèi)參蛋白的選擇應(yīng)基于實(shí)驗(yàn)樣本的物種來(lái)源。對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織樣本，常用的內(nèi)參包括β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B等。這些蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)穩(wěn)定，適合作為內(nèi)參。

跨物種反應(yīng)性：當(dāng)研究涉及多個(gè)物種時(shí)，應(yīng)選擇具有廣泛物種反應(yīng)性的內(nèi)參，或根據(jù)具體物種選擇特異性內(nèi)參。

2. 目的蛋白分子量

分子量差異：為了避免信號(hào)干擾和圖像解析的復(fù)雜性，內(nèi)參蛋白的分子量應(yīng)與目的蛋白保持顯著差異。一般建議內(nèi)參蛋白與目的蛋白的分子量相差5kDa以上。

3. 目的蛋白表達(dá)部位

亞細(xì)胞定位：根據(jù)目的蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位選擇相應(yīng)的亞細(xì)胞器內(nèi)參。例如，核蛋白檢測(cè)可選擇Lamin A、Lamin B、Histone H3等核內(nèi)參；膜蛋白檢測(cè)可選擇ATP1A1等膜內(nèi)參；線粒體蛋白檢測(cè)可選擇VDAC1和COX IV等線粒體內(nèi)參。

表達(dá)一致性：確保內(nèi)參蛋白與目的蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)部位一致，以提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的內(nèi)部一致性。

4. 實(shí)驗(yàn)條件影響

穩(wěn)定性評(píng)估：在選擇內(nèi)參時(shí)，需要充分了解實(shí)驗(yàn)條件對(duì)內(nèi)參蛋白表達(dá)的影響。某些實(shí)驗(yàn)條件（如缺氧、糖尿病、藥物處理等）可能會(huì)導(dǎo)致特定內(nèi)參蛋白的表達(dá)水平發(fā)生變化。

適應(yīng)性選擇：選擇那些在實(shí)驗(yàn)條件下表達(dá)穩(wěn)定、受影響較小的內(nèi)參蛋白。例如，在缺氧條件下，GAPDH的表達(dá)可能會(huì)增高，因此不適合作為內(nèi)參；而在凋亡實(shí)驗(yàn)中，Lamin等也可能不適合作為內(nèi)參。

5.文獻(xiàn)參考和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

文獻(xiàn)查閱：查閱相關(guān)文獻(xiàn)了解不同內(nèi)參蛋白在不同實(shí)驗(yàn)條件下的表現(xiàn)，以獲取有價(jià)值的參考信息。

二、選擇內(nèi)參的注意事項(xiàng)

選擇內(nèi)參的注意事項(xiàng)主要包括考慮目的蛋白分子量、種屬特異性、蛋白表達(dá)位置、試驗(yàn)處理?xiàng)l件對(duì)內(nèi)參表達(dá)的影響，以及確保內(nèi)參蛋白的穩(wěn)定性。?

?1. 目的蛋白分子量?：

選擇內(nèi)參抗體時(shí)，應(yīng)考慮目的蛋白分子量的大小，通常應(yīng)保證目的蛋白與內(nèi)參蛋白分子量相差5KDa以上。例如，如果目的蛋白分子量為45KDa，則不宜選擇分子量為42KDa的β-actin作為內(nèi)參，而可以考慮選擇分子量為36KDa的GAPDH作為內(nèi)參?。

?種屬特異性?：不同種屬的樣本內(nèi)參蛋白不同。例如，哺乳動(dòng)物的組織或細(xì)胞樣本通常選擇β-actin、β-tubulin、GAPDH等，而植物來(lái)源的實(shí)驗(yàn)樣本則可能選擇Plant actin、Rubisco等?。

?2. 蛋白表達(dá)位置?：

內(nèi)參的選擇還需考慮蛋白的表達(dá)部位。不同的表達(dá)部位可能需要不同的內(nèi)參蛋白。例如，細(xì)胞骨架相關(guān)的研究不宜選擇β-actin作為內(nèi)參，因?yàn)?/span>β-actin是細(xì)胞的一種重要骨架蛋白，其表達(dá)量非常豐富，但在某些特殊情況下，如脂肪組織中，β-actin的表達(dá)量很少，此時(shí)β-actin就不再適用?。

?3. 試驗(yàn)處理?xiàng)l件?：

試驗(yàn)處理?xiàng)l件對(duì)內(nèi)參表達(dá)的影響也是一個(gè)重要的考慮因素。例如，GAPDH是糖酵解過(guò)程中的酶，關(guān)于糖代謝的研究（如糖尿病模型）中不宜選擇GAPDH作為內(nèi)參，因?yàn)槟承┘?xì)胞中缺氧也會(huì)影響GAPDH的表達(dá)。此外，腫瘤組織中的GAPDH相對(duì)于正常組織是高表達(dá)的，有文獻(xiàn)報(bào)道GAPDH可以作為腫瘤標(biāo)志物，因此在比較腫瘤組織與正常組織時(shí)，也不宜選擇GAPDH作為內(nèi)參?。

?4. 內(nèi)參蛋白的穩(wěn)定性?：

內(nèi)參蛋白的穩(wěn)定性是選擇內(nèi)參的關(guān)鍵因素之一。內(nèi)參蛋白應(yīng)能在不同的實(shí)驗(yàn)條件下保持相對(duì)穩(wěn)定的表達(dá)水平，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。內(nèi)參蛋白的穩(wěn)定性可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)前的樣品前處理來(lái)保證，但在某些特殊條件下，內(nèi)參蛋白的表達(dá)也可能發(fā)生變化?。

三、常用內(nèi)參