細(xì)胞培養(yǎng)的一般過程

一、準(zhǔn)備工作 

  準(zhǔn)備工作對開展細(xì)胞培養(yǎng)異常重要，工作量也較大，應(yīng)給予足夠的重視，推備工作中某一環(huán)節(jié)的疏忽可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗或無法進(jìn)行。準(zhǔn)備工作的內(nèi)容包括器皿的清洗、干燥與消毒，培養(yǎng)基與其他試劑的配制、分裝及滅菌，無菌室或超凈臺的清潔與消毒，培養(yǎng)箱及其他儀器的檢查與調(diào)試。

二、取材

 在無菌環(huán)境下從機(jī)體取出某種組織細(xì)胞（視實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩ǎ?jīng)過一定的處理（如消化分散細(xì)胞、分離等）后接入培養(yǎng)器血中，這一過程稱為取材。如是細(xì)胞株的擴(kuò)大培養(yǎng)則無取材這一過程。機(jī)體取出的組織細(xì)胞的shou次培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。

理論上講各種動物和人體內(nèi)的所有組織都可以用于培養(yǎng)，實(shí)際上幼體組織（尤其是胚胎組織）比成年個(gè)體的組織容易培養(yǎng)，分化程度低的組織比分化高的容易培養(yǎng)，腫瘤組織比正常組織容易培養(yǎng)。取材后應(yīng)立即處理，盡快培養(yǎng)，因故不能馬上培養(yǎng)時(shí)，可將組織塊切成黃豆般大的小塊，置4℃的培養(yǎng)液中保存。取組織時(shí)應(yīng)嚴(yán)格保持無菌，同時(shí)也要避免接觸其他的有害物質(zhì)。取病理組織和皮膚及消化道上皮細(xì)胞時(shí)容易帶菌，為減少污染可用抗菌素處理。

三、培養(yǎng) 

  將取得的組織細(xì)胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的過程稱為培養(yǎng)。如系組織塊培養(yǎng)，則直接將組織塊接入培養(yǎng)器皿底部，幾個(gè)小時(shí)后組織塊可貼牢在底部，再加入培養(yǎng)基。如系細(xì)胞培養(yǎng)，一般應(yīng)在接入培養(yǎng)器皿之前進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按要求以一定的量（以每毫升細(xì)胞數(shù)表示）接入培養(yǎng)器皿并直接加入培養(yǎng)基。細(xì)胞進(jìn)入培養(yǎng)器皿后，立即放入培養(yǎng)箱中，使細(xì)胞盡早進(jìn)入生長狀態(tài)。

正在培養(yǎng)中的細(xì)胞應(yīng)每隔一定時(shí)間觀察一次，觀察的內(nèi)容包括細(xì)胞是否生長良好，形態(tài)是否正常，有無污染，培養(yǎng)基的PH是否太酸或太堿（由酚紅指示劑指示），此外對培養(yǎng)溫度和CO₂濃度也要定時(shí)檢查。

  原代培養(yǎng)一般有一段潛伏期（數(shù)小時(shí)到數(shù)十天不等），在潛伏期細(xì)胞一般不分裂，但可貼壁和游走。過了潛伏期后細(xì)胞進(jìn)入旺盛的分裂生長期。細(xì)胞長滿瓶底后要進(jìn)行傳代培養(yǎng)，將一瓶中的細(xì)胞消化懸浮后分至兩到三瓶繼續(xù)培養(yǎng)。每傳代一次稱為“一代”。二倍體細(xì)胞一般只能傳幾十代，而轉(zhuǎn)化細(xì)胞系或細(xì)胞株則可無限地傳代下去。轉(zhuǎn)化細(xì)胞可能具有惡性性質(zhì)，也可能僅有不死性（Immortality）而無惡性。

四、凍存及復(fù)蘇

  （詳細(xì)關(guān)于凍存的操作步驟、凍存的原理以前有發(fā)過，可點(diǎn)擊跳轉(zhuǎn)）為了保存細(xì)胞，特別是不易獲得的突變型細(xì)胞或細(xì)胞株，要將細(xì)胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度－196℃，將細(xì)胞收集至凍存管中加入含保護(hù)劑（一般為二甲亞砜或甘油）的培養(yǎng)基，以一定的冷卻速度凍存，最終保存于液氮中。在極低的溫度下，細(xì)胞保存的時(shí)間幾乎是無限的。復(fù)蘇一般采用快融方法，即從液氮中取出凍存管后，立即放入37℃水中，使之在一分鐘內(nèi)迅速融解。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)器皿中進(jìn)行培養(yǎng)。

凍存過程中保護(hù)劑的選用、細(xì)胞密度、降溫速度及復(fù)蘇時(shí)溫度、融化速度等都對細(xì)胞活力有影響。

五、常用儀器設(shè)備 

  無菌室,超凈工作臺,三重純水蒸餾器,抽氣泵,壓力蒸氣消毒器,電熱恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)器具，CO₂培養(yǎng)箱,恒溫水浴鍋，倒置顯微鏡,離心機(jī),無菌過濾器，洗刷裝置,細(xì)胞計(jì)數(shù)板和電子細(xì)胞技術(shù)儀等等。

六、常用細(xì)胞培養(yǎng)基

(1)MEM細(xì)胞培養(yǎng)基系列

(2)DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基系列

(3)RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基系列

(4)199細(xì)胞培養(yǎng)基系列

(5)水解乳蛋白細(xì)胞培養(yǎng)基

(6)歐氏平衡鹽

(7)F-10,F-12細(xì)胞培養(yǎng)基系列

(8)其它類型細(xì)胞培養(yǎng)基