WB實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)不同情況的條帶問題怎么解決呢？

Western blot是一個(gè)非常基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)，但是著實(shí)讓我們頭疼，即使是老手也擋不住WB實(shí)驗(yàn)的千錘百煉，懂得都懂，當(dāng)WB實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)不同情況的條帶問題怎么解決呢？我們一起來(lái)探討一下，希望對(duì)正在做WB實(shí)驗(yàn)的小伙伴提供一個(gè)避雷參考！

情況一：條帶呈笑臉狀

1.遷移過(guò)快或電泳溫度過(guò)高：降低電壓或低溫電泳。

2.配膠問題，凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好遷移過(guò)快：重新配膠，電泳槽老化換新。

情況二：條帶呈皺眉狀

配膠問題，可能是裝置不合適特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡或者凝膠兩邊聚合不wan全。

情況三：條帶彌散或拖尾

1. 蛋白上樣量過(guò)多：降低上樣量。

2. 電泳結(jié)束后未立即轉(zhuǎn)膜：電泳后盡快轉(zhuǎn)膜。

3. 蛋白降解：加入蛋白酶抑制劑。

4.樣品核酸污染：可進(jìn)行超聲及核酸酶處理或樣品有不溶物，可稀釋，充分裂解或離心操作。

情況四:條帶偏斜

電極不平衡或者加樣位置偏斜。

情況五：條帶向兩邊擴(kuò)散，不完整

1.抗體孵育不均一，或未充分結(jié)合：增加抗體孵育時(shí)間，建議4℃過(guò)夜孵育。

2.抗體濃度偏低：使用高濃度抗體。

3.化學(xué)發(fā)光液未加均一：適當(dāng)增加化學(xué)發(fā)光液的量。

4.反應(yīng)時(shí)間不夠：增加化學(xué)發(fā)光顯色反應(yīng)的時(shí)間。

情況六：條帶空心

可能由于蛋白濃度過(guò)高導(dǎo)致的底物消耗完畢，建議稀釋樣本濃度。

情況七：條帶有不均勻的污點(diǎn)

1.膜上有氣泡：轉(zhuǎn)膜時(shí)將PVDF膜慢慢貼膠上后，可以用玻璃棒輕輕滾動(dòng)，以驅(qū)趕膜與澆之間的氣泡。

2.設(shè)備污染：確保設(shè)備清洗干凈。

3.孵育或洗滌溶液不足，確保孵育洗滌充分。

4.封閉液未混勻，確保混勻，使用新鮮的封閉液，避免顆粒不溶物。

5.膜被污染：實(shí)驗(yàn)操作人員戴手套和口罩，穿實(shí)驗(yàn)服，保持膜的干凈。禁止用手直接觸摸膜。

情況八：深背景出現(xiàn)白色反光條帶

中心部位高濃度 HRP 將底物消耗過(guò)快，中間部位底物消耗完后無(wú)法發(fā)光。

1.蛋白上樣量過(guò)多：降低蛋白上樣量。

2.一抗二抗?jié)舛冗^(guò)高：適當(dāng)加大抗體稀釋。

情況九：啞鈴型條帶

1. 配膠問題，可能拔膠時(shí)用力過(guò)猛，導(dǎo)致膠變形突起：重新配膠。

2. 蛋白質(zhì)有雜質(zhì)。

情況十：出現(xiàn)非均一性背景，臟亂

膜可能曾經(jīng)干過(guò)：可在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要保證膜一直處于濕潤(rùn)狀態(tài)。

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